Nat Commun︱Philipp Kapranov团队揭示哺乳动物AP位点基因组分布模式

Original 曹慧芬，蔡烨岚翰生命科学 2023-03-10

收录于合集 #基因损伤与修复 10个

撰文︱曹慧芬，蔡烨

责编︱王思珍，方以一

编辑︱杨彬薇

DNA 损伤在生物体的每个细胞中不断发生。各种内源性或外源性因素可引起DNA 结构变化或化学损伤，包括DNA 链断裂、碱基丢失和碱基的化学修饰等多种类别[1, 2]。由于DNA在细胞信息库的核心作用，DNA损伤及相应的细胞应答对基础科学和人类的健康至关重要[3]。此外，DNA损伤在大多数主要的衰老理论中占据核心地位[4]。脱(无)碱基位点（abasic sites，AP sites）是最常见的DNA损伤类型之一，哺乳动物细胞中估计存在50,000–200,000 个AP位点[5]。未被修复的AP位点会导致DNA复制和转录的阻滞，并引起突变[6]，此外，许多研究已表明此类位点与多种人类疾病有关[7]。

在全基因组范围内绘制单核苷酸分辨率的各种类型 DNA 损伤位点是了解 DNA 损伤对细胞的分子影响的关键。据了解，目前仅有两种方法可以检测哺乳动物基因组中的AP位点，分别是AP-seq[8]和snAP-seq[9]，其中只有后者具有核苷酸水平的精度。然而，snAP-seq依赖于定制探针和复杂的有机化学过程，这限制了该方法在普通分子生物学实验室中的使用；此外，这两种方法都可能检测到DNA中含有醛基的其他化学修饰类型，从而在特异性上具有一定的局限性。更重要的是，任何研究方法都可能显示出一定程度上的偏差，不同方法的应用可以促进人们对AP位点（或其他DNA损伤类型）基因组特征的真正理解。

2022年10月5日，华侨大学医学院基因组学研究所Philipp Kapranov教授团队在Nature Communications上在线发表了题为“Complex genomic patterns of abasic sites in mammalian DNA revealed by a high-resolution SSiNGLe-AP method”的文章，发布了可应用于多种哺乳动物组织细胞类型的AP位点检测新方法SSiNGLe-AP，以碱基分辨率揭示哺乳动物DNA中全基因组AP位点分布模式。该研究表明AP位点在哺乳动物基因组中非随机分布，其在特定的基因组位置（包括调控元件、基因和单核苷酸热点等）上动态富集，且受到基因表达、年龄和组织类型的显著影响。该文章于2022年10月18日被该杂志选为“生物技术与方法”领域2022亮点文章。

SSiNGLe-AP是建立在该研究团队发表的世界上首个单核苷酸分辨率的SSB（DNA单链断裂）检测技术——SSiNGLe（Cao et al, Nature Communications, 2019，期刊亮点研究）的基础上，进一步拓展开发的适用于AP位点检测的研究方法。如图1所示，该技术1）将基因组DNA进行片段化及2）DNA变性；3）通过末端转移酶(TdT)将生物素化的ddCTP添加到由片段化产生的以及内源性的DNA 3’OH末端；4）使用链霉亲和素磁珠特异性富集生物素化且末端封闭的单链DNA；5）用人源脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶APE1识别并剪切AP位点，从而释放出位于AP位点5’端的含有新的自由3’OH末端的DNA片段；6）收集上清液中的DNA片段并纯化；7）使用适用于Illumina平台的SSiNGLe-ILM方法，对APE1产生的新的断裂位点进行标记及建库。具体的建库流程为，首先通过ployA加尾对断裂位点进行标记；然后使用ployT引物进行线性PCR，扩增出第二条DNA链；接着，对新的DNA链进行polyC加尾；最后，用分别含有polyG和polyT以及Illumina接头序列的引物进行巢式PCR，完成文库构建并用于NGS测序。

图1 单核苷酸精度AP位点检测方法SSiNGLe-AP